中药所具备的药效是得到世界公认的，特别是在近期对于全球新冠肺炎的防治中发挥了举足轻重的作用，近两年来国家和地方政府密集出台了一系列支持中药发展的法规和政策，2022年03月29日出台了《关于印发“十四五”中医药发展规划的通知》对于中药的发展提供了极大利好。对中药展开深入的开发和利用，保证药品的安全性和有效性，研究清楚具体的有效成分十分必要。
传统的分离提取技术手段包括溶剂浸提法、分馏法、吸附法、沉淀及盐析法、升华法、结晶和重结晶、膜分离方法、各种色谱技术等。传统的色谱技术如柱色谱、制备高效液相色谱等都需要某种固态的载体或支撑体，以承载或支撑两溶剂中的一相作为固定相。这种固态物质的存在，往往对物质的分离提纯造成一定的影响，如因吸附作用引起的样品损失，样品组分的化学变性，样品回收率低等问题。因此对于含量低、结构和性质相似以及不易结晶的化合物的分离往往存在一定的局限性。美国国立卫生院的YiochiroIto博士在20世纪80年代发明了一种新型液-液萃取和分配色谱分离法，即高速逆流色谱法（High-speed Counter current Chromatography，简称HSCCC）。HSCCC分离技术具有产品纯度高、分离效率高、溶剂消耗量低、制备量高且不吸附、不粘染的特点。自从HSCCC被提出和应用，其在中药有效化学成分纯化分离中就凸显了强大的优势，拥有广阔的应用前景。本文主要对该技术的工作原理及其在中药分离和分析中的应用进行探讨。
1. 高速逆流色谱技术简介
HSCCC是由储液罐、泵、螺旋管分离柱、检测器、色谱工作站以及馏分收集器等部分组成[1]，见图1a。
图1.HSCCC的组成（a）和工作原理（b）
在HSCCC整个分离装置中，自转轴与公转轴平行安装，通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向的自转,这种特殊的分离装置使HSCCC建立了一种特殊的流体动力学平衡，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），在螺旋柱中两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋管的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小依次被洗脱，从而实现分离。分离原理见图1b。
HSCCC 的固定相和流动相都是液体，区别于其他色谱技术，具有以下优缺点[2]：
2. HSCCC在中药分析中的应用
图2. HSCCC在中药分离和分析用的应用场景
分离与制备中药和天然产物的生物活性成分，是进行结构鉴定和药理药效学研究的基础工作。HSCCC技术采用液液分配原理，避免了固体载体对成分的吸附和降解作用，被广泛用于中药及天然产物中黄酮、生物碱、木脂素、三萜和多酚类等化学成分的分离[1,3]。（1）对于黄酮苷类等较大极性成分，通常使用乙酸乙酯-水为基本组成的溶剂系统，如莲、假泽兰、葡萄籽中黄酮苷类成分的分离。朱晓娜等以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水-冰醋酸（1:1:1:1:0.05）为两相溶剂，从槐花中分离出芦丁和槲皮素，其纯度均在97%以上[4]。（2）生物碱类成分大多可以选用正己烷(石油醚)-乙酸乙酯-甲醇(乙醇)-水的溶剂体系。（3）多数萜类成分极性较小，溶剂系统多采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、石油醚-乙醇-水，如乳香中乳香酸类成分、灵芝中灵芝酸的分离。（4）针对多酚类成分，通常选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂系统，如分离夜来香籽和柿中的没食子酸。而对于聚合度高、分子量较大、羟基个数较多的多酚类成分，则采用正丁醇-水为基础构成的溶剂体系，这类成分在紫外光下有较好的吸收，可采用紫外检测器进行检测。
3. HSCCC研究进展
目前，HSCCC中常用的检测器有可见光检测器、紫外光检测器，但有时组分对可见光或紫外光无吸收，或固定相的流失导致流出液乳化时则无法使用。现在已经出现了HSCCC与电子电离质谱（EMS）、化学电离质谱（CMS）、快速原子轰击质谱（FABMS）、热喷雾质谱（TSPMS）和电喷雾质谱（ESMS），甚至核磁（NMR）联用，与HPLC-DAD-
MS联用的示意图见图3。如M. Paulina Rodnguez-Rivera 等采用HSCCC和LC-ESI- MS/MS分析了甜青柠果皮多酚的代谢图谱[5]。
图3. HSCCC与HPLC-DAD-MS联用示意图
4. 小结
中药药效物质基础研究对于推动中医药现代化进程至关重要，中药及天然产物的活性成分是新药发现的重要来源。随着复方药效物质基础研究的推进，中药复方药效物质基础虽未完全阐明，但在不同层面上都取得了一定进展。如若实现进一步的突破，更需思想与方法的多元化，单一提取纯化及分析方法均各自的应用范围和局限性。HSCCC技术不仅可以分离得到单体成分，还可以实现全成分分段分离，发现活性部位甚至活性成分，这在一定程度上克服了中医复方研究中药效成分种类众多、含量悬殊带来的挑战。近些年，基于溶剂体系、洗脱方式、检测技术以及与其他分离技术联用的创新研究，极大地推动了HSCCC技术的应用，具有十分重要的意义。
虽然HSCCC技术不断进步，但其广泛应用仍然受到制约。首先，HSCCC是一种相对较新的分离纯化技术，尽管它具有许多优于其他技术的优点，但是人们对他的认识和理解还需要一个逐步深入的过程，因而影响了这种技术的推广；尽管有学者建立了经验性的溶剂体系筛选方法，但在实际应用中受到操作者个人经验的影响，仍无溶剂选择的统一原则和标准。另外，目前HSCCC技术虽已经实现了上百毫克级乃至数十克级成分的分离制备，但对于数百克级甚或公斤数量级的制备能力还有待提高。相信随着科学技术的进步与发展，HSCCC技术将为中药复方药效物质基础研究提供更加完备的技术支撑。